Etudiants : Pierre LAURENCE, Emmanuel MICHELLON
Responsables : Valérie LECLERE, Philippe JACQUES

Synthèse de lipopeptides :

1- Intérêts du mécanisme de NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetase)

Contrairement à la voie de synthèse protéique ribosomale, qui n’utilise que les 20 acides aminés de base (plus quelques exceptions) pour produire des peptides, le mécanisme de NRPS en utilise plus de 300 (D-amino acides, N-méthylés …). Ce mécanisme permet en outre des synthèses spécifiques telles que la cyclisation d’un peptide ou dans notre cas de lier un peptide à un acide gras.
Le nombre croissant d’organismes pathogènes de plus en plus résistants aux thérapies traditionnelles requiert des concepts innovants pour créer de nouveaux médicaments. Grâce à la grande diversité de leurs structures et de leurs fonctions, les peptides synthétisés par les NPRS proposent une réponse à cette demande.

2- Synthèse des lipopeptides

La synthèse de lipopeptides se déroule en deux parties différentes à savoir la synthèse de la partie lipidique ainsi que sa liaison à un premier acide aminé. Puis ensuite celle du peptide dont le premier acide aminé est lié à l’acide gras.
Bien que différentes, ces deux parties possèdent un point commun : une organisation modulaire où chaque composant interagit avec les modules adjacents et/ou divers cofacteurs.

2.1- Partie lipidique

I. Le domaine Acyl CoA-ligase (AL) couple un coenzy La synthèse de la partie lipidique du lipopeptide se déroule grâce à plusieurs modules successifs permettant le couplage, l’activation et la liaison d’un acide gras. Ceci se déroule selon les 5 étapes suivantes :meA à un acide gras (réaction ATP-dépendante).
L’acide gras activé est ensuite transféré au cofacteur 4-Phosphopantetheine du premier domaine Acyl-carrier protein (ACP 1). De même un malonyl CoA est fixé au domaine ACP2.
II. Condensation de malonyl et d’acyl thioesters catalysés par le domaine de ß-ketoacyl (KS) synthétase qui entraine la formation de ß-ketoacyl thioester. Celui-ci sera converti en ß-amino acide gras par transamination.
III. Le ß-amino acide gras est transféré au domaine de thiolation grâce au domaine de condensation.
IV. Le ß-amino acide gras est couplé à l’acide aminé fixé sur le premier module de synthèse de la partie peptidique.

 

2.2- Partie peptidique

La partie qui est responsable de la synthèse du peptide est formée de plusieurs modules. Chacun d’eux possède plusieurs domaines et est chargé de l’incorporation d’un acide aminé spécifique.

Cela sous-entend pour les modules de posséder une organisation commune leur permettant d’activer un acide aminé fixé et de le lier par une liaison à un autre acide aminé, mais également une certaine spécificité pour leur permettre la fixation d’un acide aminé plutôt qu’un autre et éventuellement de réaliser sur une modification de ce dernier (ex : épimérisation, méthylation, …).

De ce fait il a été prouvé qu’un module d’élongation doit au minimum contenir 3 domaines :
• Adénylation (A) : domaine central dans l’action des peptides synthétases. Il permet la reconnaissance d’un acide aminé spécifique et son activation grâce à une réaction d’adénylation sur ce dernier (transformation de l’acide aminé en aminoacyl adénylate). Ce sont certaines spécificités de ce module qui entraîneront l’activation d’un acide aminé bien précis.
• Thiolation (T ou PCP pour Peptidyl Carrier Protein) : permet au peptide en cours de synthèse de rester fixé à la synthétase tout au long du processus d’élongation via une liaison thioester.
• Condensation (C) : permet la formation de la liaison peptidique entre deux acides aminés.

Il existe aussi d’autres domaines permettant d’entraîner des réactions de transformation des acides aminés fixés. Notons le domaine d’épimérisation (E) qui entraîne une réaction permettant de former un épimère de l’acide aminé concerné (passage d’une configuration L vers D).

 

3- Schéma récapitulatif :

Voici le schéma détaillé des différents modules et domaines codés par l’opéron de la mycosubtiline synthétase :

 

Travail réalisé :

1- Recherches biologiques

Nous avons commencé par nous familiariser avec les mécanismes de NRPS et de synthèse d’acides gras. Pour cela nous avons recherché et analysé divers articles présents sur le web et notamment dans PubMed.

Nous avons ainsi découvert que l’acide gras qui sera inséré sur le lipopeptide n’est pas directement synthétisé par les différents modules mais incorporé du milieu et éventuellement transformé. De plus, la nature de l’acide gras incorporé dépend de la structure tridimensionnelle de la synthétase, mais aussi des acides gras présents dans le milieu.
A cause des multiples paramètres à prendre en compte et de la fiabilité très relative des prévisions de structures tridimensionnelles, il nous semblait difficile de mettre au point un logiciel autonome capable de prévoir la nature des acide aminés incorporés au lipopeptide.

Nous avons ensuite recherché les différents motifs conservés dans la partie lipidique de la synthétase. Pour cela nous avons essayé d’isoler les différents domaines (AL, ACP, KS, AMT), puis de trouver des domaines semblables chez d’autres micro-organismes à l’aide de blastP. Nous avons trouvé des articles qui donnaient une description de quelques motifs reconnus dans plusieurs domaines, nous avons donc utilisé Phi-Blast qui permet d’aligner des séquences répertoriées dans une banque satisfaisant à un motif particulier. Cette étape nous a permis de filtrer les séquences non désirées et d’avoir ainsi des alignements de plusieurs séquences présentant les mêmes fonctions (voir exemple). Nous avons ainsi sélectionné mes motifs récurrents dans ces séquences pour chaque domaine.

Une autre tâche consistait à reconnaître quel acide aminé spécifique pouvait être activé par un domaine d’adénylation. Pour cela un article parut récemment a localisé certains acides aminés importants sur la gramicidin synthétase (GrsA).
Ainsi un motif Prosite du type : D-A-X(2)-W-X(38)-T-X(20)-I-X-A-X(20)-A-X(7)-I-X(186)-K serait responsable de l’ajout d’une L-Phe dans la chaîne peptidique. On s’aperçoit que seuls quelques acides aminés importants sont dispersés sur une chaîne d’environ 200. De plus les emplacements de chaque acide aminé peuvent varier. Notre idée a donc été d’aligner le domaine d’adénylation étudié avec GrsA afin de repérer par la suite les emplacements des acides aminés du domaine étudié alignés avec les acides aminé déterminant de Grsa.(voir le mécanisme ci dessous).

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2- Implémentation du logiciel

Comme le projet a été commencé l'année dernière, nous avons donc récupéré l'existant : un logiciel codé en JAVA. Nous avons découvert que la reprise d'un code n'est pas chose forcément aisée. En même temps que nos recherches, nous avons écouté les remarques des utilisateurs pour améliorer l'ergonomie générale du logiciel.

Le logiciel est maintenant plus simple et plus rapidement utilisable :

•  Amélioration de l'interface en générale : possibilité d'un simple copier/coller d'une séquence pour en lancer son analyse, les fenêtres de résultats sont mieux gérées pour permettre à l'utilisateur d'avoir tout sous les yeux…

•  Des résultats exportables : ceux-ci peuvent être sauvegardés en HTML pour ensuite être imprimés ou modifiés sous MS Word.

•  Création de fichiers de configurations : maintenant l'utilisateur peut créer ses propres configurations de recherches de modules.

•  Création d'un exécutable d'installation : le déploiement et le lancement du logiciel sont donc largement simplifiés.

Fruits de nos recherches, nous avons rajouté des nouvelles fonctions :

•  Localisation des domaines de la partie lipidique.

•  Reconnaissance de l'acide aminé activé par un domaine d'adénylation : pour cela nous effectuons un alignement local avec Grsa et ainsi nous repérons les acides aminés d'intérêt. Nous identifions l'acide aminé grâce à une liste de séquences consensus.

Bilan du projet :

Lors du choix de notre projet nous désirions tous deux un sujet qui nous permettrait de mettre équitablement en pratique nos connaissances biologiques et informatiques. De ce point de vue là, ce projet a répondu à nos attentes car notre travail était divisé selon trois tâches : compréhension d’articles biologiques, recherche et utilisation d’outils de bioinformatique, et implémentation du logiciel.

Nous nous sommes aussi rendu compte des conséquences de notre double champ d’action, la compréhension mutuelle entre informaticiens et biologistes n’est pas des plus aisées et la communication constitue une part non négligeable du temps de travail.

Bibliographie :

“The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase”
E. H. Duitman, L.W. Hamoen, M. Rembold, G Venema, H Seitz, W. Saenger, S. Bernhard, R. Reinhardt, M. Schmidt, C. Ullrich, T. Stein, F. Leenders, J. Vater.

“Predictive, structure-based model of amino acid recognition by
nonribosomal peptide synthetase adenylation domains”
Gregory L Challis, Jacques Ravel and Craig A Townsend

“Cloning, Sequencing, and Characterization of the Iturin A Operon”
K. Tsuje, T. Akiyama, M. Shoda

“A multifunctional polyketide–peptide synthetase essential for albicidin biosynthesis in Xanthomonas albilineans”
Guozhong Huang, Lianhui Zhang, and Robert G. Birch

"A Space-Efficient Algorithm for Local Similarities"
Xiaoqiu Huang; Ross C. Hardison and Webb Miller

Contacts :

- Etudiants -

• Emmanuel MICHELLON – emmanuel.michellon@laposte.net
• Pierre LAURENCE – p.laurence@etudiants.univ-lille1.fr

- Responsables du projet -

• Valérie LECLERE– valerie.leclere@univ-lille1.fr
• Philippe JACQUES– philippe.jacques@iaal.eudil.fr

- Responsables du DESS -

• Maude PUPIN– pupin@lifl.fr
• Hélène TOUZET – touzet@lifl.fr